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本制品是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂。已经将热启动HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR Green I等试剂预混成一种适合Real-Time PCR反应检测用预混试剂，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等特点。使用时只需加入模板和引物和水，便可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对目的基因进行准确定量检测，重复性好，可信度高。

本品采用全新的Hotmaster Taq DNA聚合酶，一般的热启动DNA聚合酶只在第一步温度升高之前封闭酶的活性，而Hotmaster Taq DNA聚合酶是利用抑制剂通过温度调节方式封闭Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物结合位点，温度低于40℃时，形成非活性的酶-抑制剂复合物，当温度升高至引物特异性的退火温度时，结合平衡向模板-特异性引物复合物形成方向移动，因此最大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增产物产生，大大提高了荧光定量PCR反应的精确性。

• 本制品含独立包装100×ROX Reference Dye，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料和加入浓度，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
  
• 本制品含SYBR Green I强光下易分解，降低敏感度，使用时避免长时间强光照射本制品。
  
• 建议在冰上配制PCR反应液，再放入PCR仪器中扩增。可以提高扩增特异性，减少背景。
  
• 本制品含有4mM MgCl₂（反应体系终浓度是2mM Mg²⁺），可用25mM MgCl₂优化Mg²⁺浓度。

• 配制反应体系：
  

  成分	25μL体系	50μL体系	终浓度
  2×SYBR Green qPCR Mix	12.5μL	25μL	1×
  模板DNA	1μL	2μL	as required
  Forward Primer (10μM)	0.5μL	1μL	0.2μM each
  Reverse Primer (10μM)	0.5μL	1μL	0.2μM each
  ddH2O	至25μL	至50μL	-

• PCR反应程序：
  本制品兼容性强，适用于不同厂家、型号的荧光定量PCR仪，绝大多数情况下使用二步法和三步法均可获得良好效果。在实际使用中可以根据机型推荐和具体情况对程序加以微调。一般来说，二步法扩增特异性高，三步法扩增效率高。如果融链曲线较差，可以尝试两步法扩增；若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试加长延伸时间或者进行三步法PCR扩增。
  
  • 两步法：
    

    温度	时间	循环数
    94℃	2～3min	1
    94℃	5～10sec	40
    60℃	30～34sec
    Dissociation Stage

  • 三步法：
    

    温度	时间	循环数
    94℃	2～3min	1
    94℃	10～20sec	40
    55～60℃	10～20sec
    72℃	20～30sec
    Dissociation Stage

• 无信号值出现
  
  • 反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
    
  • 检测荧光信号的步骤有误。一般SYBR Green染料法采用72℃延伸时采集，TaqMan探针法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
    
  • 引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性。
    
  • 引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
    
  • 模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
    
  • 模板降解。避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
• CT值出现过晚
  
  • 扩增效率低，反应条件不够优化。
    设计更好的引物或探针；用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
    
  • PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
    
  • PCR产物太长。一般采用100～150bp的产物长度，一般不超过500bp。
• 标准曲线的线性关系不佳
  
  • 加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
    
  • 标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
    
  • 引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
    
  • 模板中存在抑制物，或模板浓度过高。